Phương pháp MPN (Most Probable Number) – 123doc

L ỜI NÓI ĐẦU

1.4.2 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.

Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.

Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.

– Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN. Có 2 hệ thống MPN:

Hệ thống 9 ống. Hệ thống 15 ống.

Đặc điểm: Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như sự tạo hơi: Coliforms…sự đổi màu: S. aureus.

Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn.

Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để có kết quả.

PHẦN 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loại nước giải khát chế biến sẵn không lên men, không đóng chai được bán tại khu vực xung quanh trường Đại Học Nha Trang gồm sữa đậu nành, nước rau má, nước ép cà rốt, nước ép cà chua.

Hình 2.1 Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Môi trường, hóa chất và dụng cụ a. Môi trường

Dung dịch Pepton 0,1 %

Muối Nacl, Na2HPO4 và KH2PO4

Plate Count Agar (PCA)

Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth (LSB) Môi trường EMB

Môi trường VRB-A Thuốc thử Kovac’s

Thuốc thử Methyl Red Thuốc thử α-napthol Môi trường BP Eggyorks Kháng sinh

Thạch Oxford Agar (OXA)

Môi trường tăng sinh BLEB. Thạch máu.

Môi trường test đường gồm: Môi trường cơ bản, agar 1% và canh thang đường Rhamnose, Xylose, Mantose 0,5%.

Bộ thuốc nhuộm Gram.

Hydrogen Peroxide 3%

b. Dụng cụ

Đĩa petri, pipet 1ml & 10ml, ống nghiêm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống durham Tủ ấm, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ lạnh, cân điện tử.

2.2.2 Phương pháp kiểm tra vsv

Bảng 2.1 Phương pháp kiểm tra vi sinh vật

Tên chỉ tiêu Phương pháp kiểm tra

TSVKHK TCVN 4884:2005 Coliform TCVN 6848:2007 E.coli TCVN 7924:2008 S.aureus TCVN 4830-1:2005 L.monocytogenes FDA TSNM – M TCVN 8275-1:2009

2.3Bố trí thí nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lượng vsv trong mẫu sữa đậu nành, nước rau má, nước ép cà rốt, nước ép cà chua

Phương pháp tiến hành:

Mẫu sữa đậu nành, nước rau má, nước ép cà rốt, nước ép cà chua được thu nhận ngẫu nhiên tại các hàng quán trên đường Nguyễn Đình Chiểu và Đoàn Trần Nghiệp khu vực xung quanh Trường Đại Học Nha Trang vào thời điểm buổi sáng và buổi chiều. Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc Trung Tâm Thí Nghiệm Thực Hành trong vòng 1 giờ, đảm bảo không để lây nhiễm vsv và tiến hành kiểm tra ngay sau đó.

Trạng thái mẫu đồ uống được thu nhận: dạng lỏng, có mùi vị đặc trưng, không thêm đường saccharose, không thêm nước đá. Mẫu được đựng trong túi PE của quán.

Mỗi loại đồ uống lấy 6 mẫu (3 mẫu buổi sáng, 3 mẫu buổi chiều), tại các ngày khác nhau trong thời gian thực hiện đồ án (15/02 – 12/06).

Đánh giá tình trạng mẫu:

Trong quá trình thu nhận mẫu, sơ bộ đánh giá tình hình vệ sinh của quán và tình trạng vệ sinh khi chủ quán thực hiện các công đoạn chế biến, bảo quản đồ uống trước khi thu nhận mẫu.

Mẫu nước ép cà rốt

Pha loãng

Tổng số

VKHK

Coliforms E.coli TSNM – M S.aureus L.monocytogenes

Thu nhận

Mẫu nước ép cà chua Mẫu sữa đậu

nành

Mẫu nước rau

má

Sau khi thu nhận, mẫu được kiểm tra định lượng các chỉ tiêu vi sinh vật đề xuất bằng cách pha loãng và nhận diện, đếm khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chọn lọc và test sinh hóa khẳng định.

PHẦN 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1Tình hình nhiễm vsv trong sữa đậu nành đường phố khu vực Trường Đại Học Nha Trang Học Nha Trang

Kết quả số liệu kiểm tra mật độ vsv trong sữa đậu nành khu vực xung quanh Trường Đại học Nha trang thể hiện trong bảng 3.1; 3.2 (phần kết quả) và bảng 4.1; 4.2 (phần phụ lục 2).

Bảng 3.1: Mật độ vsv trong mẫu sữa đậu nành đường phố khu vực xung quanh Trường Đại học Nha Trang

Chỉ tiêu TPC (cfu/ml) Coliform (cfu/ml) E. coli (cfu/ml) S.aureus (cfu/ml) TSNM – M (cfu/ml) Tiêu chuẩn Mẫu <102 <10 KPH KPH <10

Mẫu sữa đậu nành buổi sáng (M11)

9,6.104 3,7.102 KPH 3,2.102 <10

Mẫu sữa đậu nành buổi chiều (M12)

5,0.105 5,5.102 KPH 6,2.102 3,0.101

Trung bình 3,0.105 4,6.102 KPH 4,7.102 2,0.101

Ghi chú: (-): Không phát hiện trong 1ml mẫu.

Nhận xét:

Theo QCVN 6-2: 2010/BYT đối với các sản phẩm đồ uống không cồn, chỉ tiêu TSVKHK phải có giá trị nhỏ hơn 102 cfu/ml; Coliform, TSNM – M đều nhỏ hơn 10 cfu/ml. Riêng đối với chỉ tiêu E.coli, S.aureus không được phép có mặt trong 1ml mẫu.

Trong mẫu sữa đậu nành qua nghiên cứu thấy sự hiện diện TSVKHK, Coliform, S.aureus với mật độ lớn. Mật độ TSNM – M trong các mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi sáng đạt tiêu chuẩn. Không phát hiện thấy sự hiện diện của E.coli

lượng các vsv trong mẫu buổi chiều luôn lớn hơn trong mẫu thu nhận vào buổi sáng.

Theo tài liệu [23], TSVKHK hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, đồng thời dự báo thời hạn bảo quản của thực phẩm cũng như nguy cơ hư hỏng Khi số lượng của TSVKHK lớn hơn 106 cfu/ml thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng. Ở các mẫu sữa đậu nành kiểm tra, TSVKHK trong mẫu thu nhận cả buổi sáng và buổi chiều đều vượt tiêu chuẩn của Bộ Y tế là <102 cfu/ml. Trên mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi sáng có mật độ TSVKHK trung bình là 9,6.104 cfu/ml, trên mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi chiều có mật độ lớn hơn là 5,0.105 cfu/ml.

Coliform là nhóm trực khuẩn Gram âm có nguồn gốc từ đất, nước chất ô nhiễm, chất thải của người và động vật. E.coli thuộc nhóm Coliform, là vi khuẩn chịu nhiệt tồn tại tự nhiên trong đường ruột người và các động vật máu nóng khác vì vậy chúng thường xuyên có mặt trong chất thải. Coliform, E.coli được coi là các vi sinh vật chỉ thị y tế. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Trong quá trình chế biến và bảo quản không đảm bảo vệ sinh, các vi khuẩn này dễ dàng lây nhiễm và tồn tại trong thực phẩm.

Trong tất cả các mẫu kiểm tra, không mẫu nào đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế về chỉ tiêu Coliform. Coliform trong mẫu sữa đậu nành buổi sáng là 3,7.102 cfu/ml, buổi chiều hiện diện với mật độ lớn hơn (5,5.102 cfu/ml). Tuy số lượng Coliform hiện diện trong mẫu lớn nhưng trong tất cả mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi sáng đều âm tính với E.coli.

S.aureus tồn tại tự nhiên trên da, tóc, khoang mũi, niêm mạc…, đặc biệt là tập trung tại các vết thương bị viêm trên cơ thể người và động vật. Chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội, có khả năng cạnh tranh kém. Nguy cơ gây bệnh của chúng cao ở nhóm thực phẩm đã qua chế biến. Sự hiện diện với mật độ lớn của S. aureus

trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh cá nhân và kiểm soát kém quá trình chế biến [23].

Không có mẫu sữa đậu nành được thu nhận nào đạt chỉ tiêu S.aureus. Dù là

mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi sáng vẫn hiện diện một số lượng lớn S.aureus

(3,2.102 cfu/ml), trong mẫu buổi chiều S.aureus hiện diện với mật độ lớn hơn (6,2.102 cfu/ml).

Mật độ TSNM – M trong mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi sáng đạt tiêu chuẩn (<10 cfu/ml). Trong mẫu sữa đậu nành thu nhận vào buổi chiều TSNM – M hiện diện với mật độ lớn hơn và vượt quá tiêu chuẩn (3,0.101 cfu/ml).

Bảng 3.2: Thực trạng nhiễm khuẩn trong mẫu sữa đậu nành

Thực trạng TPC Coliform E. coli S.aureus TSNM – M Tỷ lệ nhiễm khuẩn(%) 100% 100% 0% 100% 100% Tỷ lệ nhiễm khuẩn

vượt ngưỡng tiêu chuẩn cho phép (%)

100% 83% 0% 100% 33%

Nhận xét:

Tỷ lệ nhiễm khuẩn các chỉ tiêu trong mẫu sữa đậu nành thu nhận hầu hết là 100%, trừ E.coli. Bên cạnh đó, tỷ lệ vượt quá ngưỡng tiêu chuẩn cho phép cao nhất là TSVKHK (100%), S.aureus (100%), sau đó đến Coliforms 83%, TSNM – M (33%), không phát hiện vi khuẩn E.coli.

Theo điều tra, quan sát quá trình chế biến và bảo quản tại các cơ sở bán hàng, sữa đậu nành chủ yếu được nhập về vào lúc sáng sớm, sản phẩm đã được bảo quản lạnh trước đó (thời gian bảo quản trước đó khó kiểm soát). Một số cơ sở trực tiếp nấu sữa đậu nành vào sáng sớm, sản phẩm này thường chỉ phục vụ cho bữa sáng, bán hết không còn để sang chiều.

Một vài cơ sở nhập sữa đậu nành về với số lượng lớn sau đó phân ra thành từng chai nhỏ, bảo quản trong thùng đá bán trong nhiều ngày.

Sữa đậu nành tiêu thụ mạnh vào buổi sáng, số bán không hết sẽ bảo quản lạnh tiếp tục bán, tạo điều kiện cho vsv có sẵn trong sản phẩm hay lây nhiễm trong quá trình vận chuyển và phân phối gia tăng số lượng.

Quy trình chế biến sữa đậu nành trải qua bước gia nhiệt nên các vsv sinh dưỡng dễ bị ức chế và tiêu diệt bởi nhiệt độ. Tuy nhiên nếu có sự hiện diện số lượng lớn vsv trong nguyên liệu ban đầu và thời gian gia nhiệt quá ngắn sẽ không đủ tiêu diệt vsv đến giới hạn cho phép.

Ngoài ra trong quy trình sản xuất sữa đậu nành có công đoạn vắt, nhằm tách dịch sữa ra khỏi bã đậu. Đây là công đoạn chế biến có sự tiếp xúc trực tiếp giữa tay và sản phẩm trong thời gian dài, tạo điều kiện cho S.aureus có sẵn trên tay, mũi, niêm mạc… lây nhiễm vào sản phẩm. S.aureus cũng là một loại vsv dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt tuy nhiên với mật độ lây nhiễm lớn mà thời gian gia nhiệt không đủ dài nên không thể tiêu diệt hết. Mặt khác S.aureus có tính cạnh tranh kém, trong các thực phẩm sống S.aureus bị ức chế bởi các vi khuẩn khác, nhưng trên sữa đậu nành chín khi các vsv khác bị loại bỏ đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.

Nấm men, nấm mốc hiện diện khắp nơi trong môi trường tự nhiên. Đặc biệt trên nguyên liệu đậu nành để lâu ngày trong điều kiện bảo quản và chế biến không đảm bảo sẽ dễ dàng tìm thấy sự có mặt của chúng trên thực phẩm.

3.2Mật độ vsv trong nước ép rau máđường phố khu vực Trường Đại Học Nha Trang Trang

Kết quả kiểm tra mật độ vsv trong nước ép rau má khu vực xung quanh Trường Đại học Nha Trang thể hiện trong bảng 3.3; 3.4 phần kết quả và bảng 4.3; 4.4 phần phụ lục 2.

Bảng 3.3: Mật độ vsv trong nước ép rau má đường phố khu vực Trường Đại Học Nha Trang

Chỉ tiêu TPC (cfu/ml) Coliform (cfu/ml) E. coli (cfu/ml) S.aureus (cfu/ml) TSNM – M (cfu/ml) Tiêu chuẩn Mẫu <102 <10 KPH KPH <10

Mẫu nước ép rau má buổi sáng (M21)

4,7.104 1,2.102 <1 KPH <10

Mẫu nước ép rau má buổi chiều (M22)

4,4.105 2,2.102 <1 <1 1,6.101

Trung bình 2,4.105 1,7.102 <1 <1 1,3.101

Nhận xét:

Trong mẫu nước ép rau má nghiên cứu có sự hiện diện với mật độ lớn TSVKHK, Coliform. Phát hiện thấy sự hiện diện của E.coli. Trong mẫu thu nhận vào buổi chiều có mẫu phát hiện thấy sự có mặt S.aureus. Mật độ TSNM – M trong các mẫu nước ép rau má thu nhận vào buổi sáng đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế. Qua các mẫu kiểm tra cho thấy, số lượng các vsv trong mẫu buổi chiều luôn lớn hơn trong mẫu thu nhận vào buổi sáng.

Ở các mẫu nước ép rau má kiểm tra, TSVKHK trong mẫu thu nhận cả buổi sáng và buổi chiều đều vượt tiêu chuẩn của Bộ Y tế là <102 cfu/ml. Trong mẫu nước ép rau má thu nhận vào buổi sáng có mật độ TSVKHK trung bình là 4,7.104cfu/ml, trong mẫu thu nhận vào buổi chiều có mật độ lớn hơn (4,4.105cfu/ml). Trong tất cả các mẫu kiểm tra, không mẫu nào đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế về chỉ tiêu Coliform.

Coliform trong mẫu nước ép rau má buổi sáng là 1,2.102cfu/ml, buổi chiều hiện diện với mật độ lớn hơn (2,2.102cfu/ml). Phát hiện thấy E.coli trong mẫu nước rau má thu nhận vào cả sáng lẫn chiều nhưng với mật độ thấp (<1 cfu/ml).

Trong mẫu nước ép rau má thu nhận vào buổi sáng không phát hiện thấy sự hiện diện của S.aureus. Mẫu buổi chiều phát hiện thấy sự hiện diện của S.aureus

nhưng với mật độ thấp (<1 cfu/ml).

Mật độ TSNM – M trong mẫu nước ép rau má thu nhận vào buổi sáng đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế (<10 cfu/ml). Trong mẫu nước ép rau má thu nhận vào buổi chiều TSNM – M hiện diện với mật độ lớn hơn và vượt quá tiêu chuẩn của Bộ Y tế (1,6.101 cfu/ml).

Bảng 3.4: Thực trạng nhiễm khuẩn trong mẫu nước ép rau má

Thực trạng TPC Coliform E. coli S.aureus TSNM – M Tỷ lệ nhiễm khuẩn (%) 100% 100% 33% 17% 100% Tỷ lệ nhiễm khuẩn vượt

ngưỡng tiêu chuẩn cho phép (%)

100% 100% 33% 17% 17%

Nhận xét:

Tỷ lệ nhiễm các chỉ tiêu vi sinh trong mẫu nước rau má thu nhận thường là 100%, trừ E.coli 33% và S.aureus 17%. Tỷ lệ vượt quá ngưỡng tiêu chuẩn cho phép cao nhất là TSVKHK, Coliforms (100%), sau đó đến E.coli (33%), TSNM – M (17%) và S.aureus (17%). Như vậy hầu hết các mẫu nếu đã nhiễm khuẩn thì đều trong tình trạng vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế.

Theo điều tra, quan sát quá trình chế biến và bảo quản nước giải khát tại các cơ sở bán hàng khu vực xung quanh Trường Đại học Nha Trang, nước ép rau má chủ yếu được nhập về vào lúc sáng sớm, sản phẩm đã được bảo quản lạnh trước đó (thời gian bảo quản trước đó khó kiểm soát).

Trong nghiên cứu của Trịnh Xuân Nhất trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa đã chỉ ra người kinh doanh thức ăn đường phố tỷ lệ rửa tay sau khi đi vệ sinh chỉ đạt 33,9%, khi bắtđầu làm việc 74,5% [13].

Các mẫu nước ép rau má có số lượng E.coli không đạt tiêu chuẩn ngoài lý do người chế biến và bán hàng thiếu ý thức ATTP mà còn do đặc thù môi trường sống của nguyên liệu. Rau má thường được trồng trên các ruộng, nơi có môi trường ẩm ướt, nguồn nước tưới là từ sông suối, ao hồ. Sau khi rửa, vsv trên nguyên liệu chỉ giảm bớt và do nguyên liệu không qua bước gia nhiệt nên sự hiện diện vsv trên sản phẩm là đương nhiên.

Trong nghiên cứu của Trịnh Xuân Nhất cũng cho thấy tỷ lệ ô nhiễm các vi khuẩn trên trong mẫu rau sống khá cao (66,7%). Nghiên cứu của Bùi Ngọc Quang tại thị xã Cao Bằng cho thấy các mẫu rau sống ô nhiễm vi khuẩn Coliforms cũng với tỷ lệ 100%. Theo ông Trần Đáng – cục trưởng cục VSATTP cho biết, khi xét nghiệm gần 100 mẫu rau sống tại các tỉnh Quảng Bình, Hà Tĩnh, Thanh Hoá, Hà Nam, Hải Phòng và một số nhà hàng ở Hà Nội, tất cả đều bị nhiễm E.coli và

Coliforms từ 50-500 tế bào vi khuẩn trong 1 gam rau.

Trong chất chiết rau má chứa asiaticosid có tác dụng làm tan màng sáp của một số vi khuẩn, nhờ đó gia tăng tác dụng kháng khuẩn của rau má. Tuy nhiên do mật độ vsv ban đầu trên nguyên liệu quá nhiều nên ta vẫn tìm thấy sự hiện diện của chúng trong mẫu thức uống với số lượng lớn.

Qua khảo sát quy trình chế biến và bảo quản kết quả cho thấy những mẫu có mật độ E.coli đạt tiêu chuẩn hầu hết là do người bán trực tiếp chế biến. Rau má được rửa qua ít nhất 3 lần nước hay được rửa dưới vòi nước chảy, loại bỏ những lá